HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

LINK DOWNLOAD MIỄN PHÍ TÀI LIỆU "HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD": http://123doc.vn/document/554276-hoan-thien-ph-ong-phap-va-nghien-cuu-da-dang-di-truyen-cua-cay-mam-bien-avicennia-marina-o-khu-du-tru-sinh-quyen-rung-ngap-man-can-gio-bang-ky-thuat-r.htm

iv



tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10%.
Kết quả phân tích trên phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên
bản 2.1, 7 mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách
phân nhóm là 0,40. Nhóm 1 gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ
số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00.









v



MỤC LỤC
Chƣơng Trang
Trang tựa ii
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các hình ix
Dang sách các bảng x
Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích, yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
1.2.3 Hạn chế của đề tài 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 3
2.1.1 Đa dạng sinh học 3
2.1.2 Đa dạng di truyền 3
2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 4
2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4
2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4
2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ 8
2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 9
2.3 Cây mắm biển 11


vi



2.3.1 Hình thái học 11
2.3.2 Nơi sống và sinh thái 12
2.3.3 Phân bố 12
2.3.2. Quy trình ly trích DNA thực vật 13
2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ 14
2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di 15
2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 16
2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử 16
2.5.1.1 Chỉ thị hình thái 17
2.5.1.2. Chỉ thị isozyme 17
2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA 18
2.5.2 Kỹ thuật PCR 18
2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 18
2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR 19

2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR 21
2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 22
2.5.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 22
2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD 25
2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD 25
2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 25
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 27
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 27
3.1.1 Thời gian nghiên cứu 27
3.1.2 Địa điểm thực hiện 27
3.2 Vật liệu thí nghiệm 27
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27


vii



3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA 27
3.3.2 Quy trình ly trích DNA 31
3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA 33
3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD 34
3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD 34
3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm 35
3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 38
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40
4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ 40
4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA 41
4.2.1 Bảo quản mẫu 41
4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích 41
4.3 Kết quả chạy RAPD 43
4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 43
4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng 44
4.3.3 Thí nghiiệm 3 45
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48
5.1.1 Kết luận 48
5.1.2 Đề nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 52






viii



DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp: Base pair
CNMT: Công Nghệ Môi Trƣờng
CNSH: Công Nghệ Sinh Học
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
E: East
EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid
EtBt: Ethidium bromide
N: North.
OD: Optical density
PCR: Polymerase chain reaction
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
RNA: Ribonucleic acid
RNase: Ribonuclease
T
a
: Annealing temperature
T
m
: Melting temperature
TE: Tris EDTA.
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA.
UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization
UV: Ultra Violet


ix



DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5
Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm 11
Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 21
Hình 2.4: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng

di truyền 25
Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) 41
Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 42
Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 44
Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) 44
Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 45
Hình 4.6: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 2 46
Hình 4.7: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 3 47
Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại khu dự trữ sinh quyển rừng
Cần Giờ 48












x



DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose có nồng độ khác
nhau 16
Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide có nồng độ khác
nhau 16
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 36
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 36
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm2 . 37
Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 37
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm3 38
Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 38





















1



Chƣơng 1
LỜI MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Mắm biển (Avicennia marina) là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn,
phân bố rộng khắp trên toàn thế giới trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa
triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến [17].
Sau 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng
ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là khu dự trữ sinh quyển rừng ngập
mặn vào ngày 21/01/2000 [18].
Ở nƣớc ta, cây mắm thƣờng sống ở những vùng rừng ngập mặn nhƣ Cần
Giờ, Long An, Củ Chi… dùng làm liệu xây dựng là cây có giá trị kinh tế và môi
trƣờng rất cao. Gỗ mắm đƣợc sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng,
làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than mắm cho
nhiệt lƣợng cao và ít khói. Các khu rừng mắm có vai trò vô cùng quan trọng vào
việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm
quá trình xói lở, sa mạc hoá, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng
biển. Mặt khác, các khu rừng mắm là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã.
Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học
Nông Lâm Tp. HCM, đƣợc sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện
đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ
SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.







2



1.2 Mục đích, yêu cầu
1.2.1 Mục đích
 Bƣớc đầu phân tích sự đa dạng di truyền của quần thể mắm từ các mẫu
 Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây mắm biển.
 Đánh giá về mặt di truyền quần thể mắm trồng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.
 Ứng dụng trong tuyển chọn giống mắm phục vụ cho việc tái tạo rừng
ngập mặn trong tƣơng lai.
1.2.2 Yêu cầu
 Thiết lập phƣơng pháp ly trích DNA và bƣớc đầu xây dựng quy trình
RAPD thích hợp cho cây mắm biển.
 Thu thập mẫu lá từ những cây mắm biển có tuổi khác nhau và có đặc
điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u,
có màu sắc trái khác lạ…
 Ly trích đƣợc DNA từ mẫu lá mắm với độ tinh sạch cao.
 Thu thập đƣợc bằng kỹ thuật RAPD.
 Vẽ cây phân loại loài bằng phần mềm NTSYS.
1.2.2 Hạn chế của đề tài
 Chỉ nghiên cứu đa dạng di truyền của một vài quần thể ở rừng ngập mặn
Cần Giờ
 Không có đủ điều kiện để thu thập lƣợng mẫu lớn.
 Chỉ tiến hành chạy RAPD trên 3 primer.
 Thời gian thực hiện từ 20/04/2007 đến 30/08/2007.





3



Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học
2.1.1 Đa dạng sinh học
Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên - WWF (Word Wildlife fund)
(1989), đa dạng sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn
thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là
các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại
trong môi trƣờng”.
Do vậy đa dạng sinh học đƣợc xem xét theo 3 mức độ:
 Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái
đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.
 Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các
quần thể sống cách ly về địa lý cũng nhƣ các cá thể cùng chung sống trong một
quần thể.
 Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó
các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng nhƣ các quần xã sinh vật
tồn tại và cả sự khác biệt của mối tƣơng quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình
Quyền, 2002).
 Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự
phân biệt có tầm rộng và là chiến lƣợc nghiên cứu của nhiều nƣớc trên thế giới.
2.1.2 Đa dạng di truyền
Các cá thể trong một quần thể thƣờng có genome khác nhau. Sự đa dạng về
genome đƣợc biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác
nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá
thể khác nhau là khác nhau. Những cây trồng đƣợc trồng lai ghép hay những động
vật đƣợc lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng,