Thiết lập quy trình điện di protein SDS-page và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với thuốc kháng sinh kích kháng

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Vài điều sơ lƣợc về cây lúa 3
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái của lúa 3
2.1.3 Đặc điểm hạt lúa 5
2.1.4 Điều kiện để hạt lúa nảy mầm 5
2.1.4.1 Nƣớc 5
2.1.4.2 Nhiệt độ 5
2.1.4.3 Không khí 6
2.2 Một số phƣơng pháp tách chiết protein tổng số từ thực vật 6
2.2.1 Quy trình có sử dụng SDS 7
2.2.2 Quy trình có sử dụng phenol 7
2.2.3 Quy trình có sử dụng PMSF 8
2.3 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 8
2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phƣơng pháp điện
di trên gel polyacrylamide 8
2.3.2 Gel polyacrylamide 9
2.3.3 Phƣơng pháp SDS- PAGE 10




vi

2.3.4 Nhuộm gel sau khi điện di 11
2.3.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide 13
2.3.6 Phƣơng pháp điện di hai chiều 14
2.4 Một số nghiên cứu liên quan đến điện di protein SDS- PAGE 16
2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc 16
2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc 17
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 18
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 18
3.2 Hóa chất và vật liệu dùng trong thí nghiệm 18
3.2.1 Thuốc sinh học 18
3.2.2 Hóa chất dùng trong ly trích 18
3.2.3 Hóa chất điện di 19
3.2.4 Trang thiết bị thí nghiệm 19
3.3 Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu 19
3.3.1 Chuẩn bị mẫu và lấy mẫu 19
3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu lúa 19
3.3.1.2 Xử lý thuốc và lấy mẫu 20
3.3.2 Ly trích protein tổng số từ lá lúa 21
3.3.2.1 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng SDS 21
3.3.2.2 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng phenol 21
3.3.2.3 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình cải tiến có dụng SDS 22
3.3.3 Điện di kiểm tra mẫu protein đã ly trích 23
3.3.3.1 Chuẩn bị hóa chất 23
3.3.3.2 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di 24
3.3.3.3 Tiến hành điện di và xem kết quả 24
3.3.4 Thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di 25
3.3.5 Khảo sát nồng độ gel 25
3.3.6 Điện di các mẫu protein để kiểm tra phản ứng của cây lúa đối với thuốc
sinh học kích kháng 26




vii

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1 Kết quả ly trích protein tổng số 27
4.2 Kết quả khảo sát chọn điều kiện điện di 29
4.3 Ảnh hƣởng của nồng độ gel đến kết quả điện di 30
4.4 Đánh giá phản ứng của lúa đối với thuốc sinh học 32
4.4.1 Kết quả điện di của tất cả các mẫu protein trong 12 nghiệm thức 32
4.4.2 Kết quả điện di mẫu protein của lúa ở lô II 33
4.4.3 Kết quả điện di mẫu protein của lúa ở lô III 34
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35
5.1 Kết luận 35
5.2 Đề nghị 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36




viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2- DE Two- dimensional electrophoresis
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
APS ammonium persulfate
CBB Coomassie Brilliant Blue
DTT Dithiotheitol
EDTA
Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
HPLC High performance liquid chromatography
IEF Isoelectric focusing
KDa kilo Dalton
PCR Polymerase Chain Reaction
PVDF Polyvinylidene difluoride

RADP Randomly Amplified Polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS– PAGE Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel
electrophoresis
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SSR Simple Sequence Repeats
STS Sequence Tagged Site
TEMED N,N,N’,N’-tetramethylenediamide
SDS Sodium dodecyl sulfate
TE Tris – EDTA
w/v Weight for volume









ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG

Hình 2.1 Hình thái cây lúa (Oryza sativa L.) 4
Hình 2.2 Cấu trúc protein trƣớc và sau khi làm biến tính bởi SDS 11
Hình 3.1 Lúa mầm trong hộp nhựa 2 ngày 20
Hình 4.1 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích của các quy trình 28
Hình 4.2 Kết quả khảo sát điều kiện điện di phù hợp với protein lá lúa 30
Hình 4.3 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein khảo sát nồng độ gel 31
Hình 4.4 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein của lúa trong 6 nghiệm thức
(nghiệm thức 1, 2, 3,4, 5 và 6) 32
Hình 4.5 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein của lúa trong 6 nghiệm thức
(nghiệm thức 4, 5, 6, 7, 10 và 11). 32
Hình 4.6 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein của lúa trong 5 nghiệm thức
(nghiệm thức 5, 8, 9, 10 và 12). 32
Hình 4.7 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lô II 33
Hình 4.8 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lô III 34
Bảng 3.1 Bảng bố trí phân lô thí nghiệm theo nghiệm thức 20
Bảng 3.2 Thời gian xử lý thuốc trƣớc khi lấy mẫu theo từng nghiệm thức 21
Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát điều kiện điện di 25
1





Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Lúa là cây lƣơng thực quan trọng, là nhu cầu không thể thiếu đối với con
ngƣời, đặc biệt ở các nƣớc Châu Á. Việt Nam với đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió
mùa, mƣa nhiều, ẩm độ cao, rất thích hợp cho việc trồng lúa. Mặt khác ngƣời Việt
Nam còn có truyền thống canh tác cây lúa từ rất lâu đời. Trƣớc đây, với điều kiện
vật chất còn thiếu thốn, lƣơng thực không đủ ăn ngƣời ta chỉ có nhu cầu đƣợc ăn no.
Hiện nay với mức sống ngƣời dân ngày càng đƣợc nâng cao thì ngoài nhu cầu ăn
no, việc ăn ngon, có dinh dƣỡng cao đã dần trở nên là nhu cầu quan trọng đối với
mọi ngƣời. Nhƣng hiện nay các bệnh trên cây trồng ngày càng càng hoành hành dữ
dội, gây cản trở trong sản xuất và phát triển ngành nông nghiệp.
Ngày nay, với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trên thế giới
cũng nhƣ trong nƣớc, định hƣớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong
công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hƣớng rõ rệt. Trƣớc hết là những đầu tƣ
rất lớn để khai thác và ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh,
sâu rầy hại, virus, cỏ dại và các loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp.
Theo đó hƣớng ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu các chế phẩm sinh
học có bản chất là các polyamin đang ngày càng phát triển. Đây là một hƣớng
nghiên cứu mới có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở
nƣớc ta nếu đƣợc đầu tƣ phát triển.
Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học thì các kỹ thuật về
sinh học phân tử đã ra đời nhƣ phƣơng pháp Southern blot, RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), RADP (Randomly Amplified Polymorphic
DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism),
STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến rõ rệt trong các
hƣớng nghiên cứu về acid nucleic. Tuy nhiên các phƣơng pháp sinh học phân tử
2





trên chỉ có thể tập trung nghiên cứu về gen và cấu trúc gen mà không thể cho ta biết
đƣợc sự biểu hiện của gen. Đó là nguyên nhân dẫn đến sự ra đời của của các
phƣơng pháp nhƣ sắc ký lỏng cao áp (HPLC), SDS– PAGE, Western blot, 2– D
PAGE. Về nguyên tắc thì chúng có mối liên hệ với nhau và là cầu nối cho nhau.
Trong đó, phƣơng pháp SDS– PAGE đƣợc xem là một kỹ thuật đơn giản mà đem
lại hiệu quả cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử.
Trong phạm vi cho phép chúng tôi thực hiện đề tài: “Thiết lập quy trình điện
di protein SDS- PAGE và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với
thuốc sinh học kích kháng”.
1.2 Mục đích
Thiết lập quy trình ly trích protein tổng số từ lá lúa.
Sử dụng phƣơng pháp điện di protein SDS– PAGE xác định phản ứng của cây
lúa đối với thuốc sinh học kích kháng.
1.3 Yêu cầu
Ly trích đƣợc protein tổng số từ lá lúa.
Hoàn thiện kỹ thuật điện di SDS– PAGE trên protein của lúa.
So sánh xem sự khác biệt về protein tổng số giữa mẫu lúa không xử lý thuốc
polyamin với mẫu lúa xử lý thuốc polyamin ở nồng độ khác nhau.
So sánh sự khác biệt về protein của các mẫu lúa có xử lý thuốc polyamin với
nồng độ và thời gian tác động khác nhau.








3





Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vài điều sơ lƣợc về cây lúa
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Lúa là loại thực vật đƣợc canh tác từ rất lâu đời. Về nguồn gốc của lúa trồng
chƣa đƣợc hiểu rõ ràng và có nhiều ý kiến khác nhau. Hiện nay trên thế giới có hai
cây lúa trồng. Lúa trồng Oryza sativa đƣợc thuần hóa ở Châu Á, nên đƣợc gọi là lúa
trồng Châu Á. Lúa trồng Oryza glaberrima đƣợc thuần hóa ở Châu Phi nên đƣợc
gọi là lúa trồng Châu Phi (Bùi Huy Đáp, 1999).
Các nhà khảo cổ học Mỹ cho rằng lúa trồng xuất hiện rất sớm cách đây khoảng
hơn 9 – 10 nghìn năm. Nhiều nhà khảo cổ học khác cho là lúa trồng xuất hiện cách
đây 6.000 năm, lúa trồng châu Phi (Oryza glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3.500
năm. Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau
công nguyên, cách đây khoảng 1.800 – 1.900 năm. (Bùi Huy Đáp, 1999)
Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố khá rộng, loài
O. sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia.
Diện tích gieo trồng chiếm khoảng 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144
triệu ha). Lúa gạo đƣợc trồng từ độ cao bằng mực nƣớc biển đến độ cao 3.000 m so
với mực nƣớc biển. Lúa đƣợc trồng từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới. Lúa gạo có
thể đƣợc trồng trên nhiều loại đất khác nhau đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn.
Những dòng lúa có thể đƣợc phân chia thành 3 nhóm sinh thái, Indica (ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới), Javanica ( đƣợc trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn
đới). Có hai dòng đƣợc canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica. (Bùi Huy Đáp,
1999).
2.1.2 Đặc điểm hình thái của lúa
Lúa trồng là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian sinh
trƣởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và các điều kiện sinh thái
thời gian trồng kéo dài trong khoảng từ 75 – 250 ngày.
4





Thân cao từ 70 – 150 cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2 – 3 m, hay 5 – 6
m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẵn và cách nhau bởi những lóng dài, ngắn
khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp.
Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn.
Lúa thƣờng tạo ra thành nhiều nhánh (dảnh lúa: tillers), bao gồm cọng và lá có
hoặc không có bông (panical). Nhánh bậc 1 xuất hiện từ những đốt gần thân chính
và nhánh bậc hai, bậc ba xuất hiện từ những nhánh bậc một này. Lá mọc liên tiếp
trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có
một lƣỡi bẹ và 2 thìa lìa từ cổ lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong
lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con. Cụm hoa là một chùm thƣa, thẳng,
hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15 – 30 cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuôn dài,
mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím, có hoa lƣỡng
tính, tự thụ phấn. Hoa có 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn
và hai đầu nhụy có lông tơ [11].












Về cơ bản, lúa là cây thích nghi với điều kiện có nƣớc. Ba giai đoạn chính
trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu quốc tế
IRRI là: (i) Giai đoạn tăng trƣởng: từ khi gieo hạt cho đến khi cây lúa làm đòng. (ii)
Hình 2.1: Hình thái cây lúa (Oryza sativa L.)

5





Giai đoạn sinh sản: từ khi lúa làm đòng đến khi lúa trổ bông. (iii) Giai đoạn lúa
chín: từ khi lúa trổ bông đến khi lúa chín. (Võ Tòng Xuân, 1986)
2.1.3 Đặc điểm hạt lúa
Hạt lúa là một loại quả, thuộc loại quả dĩnh. Hình thái và màu sắc của hạt lúa
tùy giống lúa. Lúa tiên (Indica) có hạt dài còn lúa cánh (Japonica) thì có hạt tròn.
Đa số hạt lúa có màu vàng sáng, một số có màu vàng sẫm hoặc nâu đen nhƣ nếp
cẩm. (Lê Minh Triết, 2003)
Về cơ bản thì cấu trúc hạt lúa gồm: Vỏ trấu gồm trấu trên và trấu dƣới. Cám
gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Phôi nhũ gồm có lớp aleuron và phôi
nhũ tích tụ tinh bột. Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở
phần dƣới của hạt.
Hạt lúa là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai vỏ
trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc dài).
Một hạt lúa có trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ.
2.1.4 Điều kiện để hạt lúa nảy mầm
2.1.4.1 Nƣớc
Hạt lúa sau khi thu hoạch và phơi khô tồn trữ, có chứa một lƣợng nƣớc nhất
định, dƣới 14% trọng lƣợng khô. Hạt muốn nảy mầm đƣợc thì lƣợng nƣớc trong hạt
phải đạt khoảng 22 – 25%. Do đó cần phải ngâm hạt trƣớc khi ủ giống để hạt hút đủ
lƣợng nƣớc cần thiết. Thời gian ngâm hạt lâu hay mau tùy thuộc vào nhiệt độ của
nƣớc ngâm và không khí, tùy hạt giống mới hay cũ. Nhiệt độ không khí cao, nƣớc
ấm và vỏ hạt mỏng thì hạt hút nƣớc nhanh, không cần ngâm quá lâu, hạt hút nhiều
nƣớc, hòa tan, làm tiêu hao chất dự trữ trong hạt, đồng thời làm hạt bị chua, nấm
bệnh dễ phát triển, hạt dễ bị thối và nảy mầm yếu. (Võ Tòng Xuân và ctv, 1986)
2.1.4.2 Nhiệt độ
Hạt lúa nảy mầm thích hợp ở nhiệt độ 30 – 35
0
C. Nhiệt độ cao trên 40
0
C hoặc
thấp hơn 17
0
C hạt khó nảy mầm, nếu kéo dài có thể làm hƣ mầm. Vì vậy sau khi
ngâm, cần ủ hạt ở nhiệt độ thích hợp. Mƣa dầm hoặc mùa lạnh hạt khó nảy mầm
nên cần ủ kỹ. Có thể tƣới thêm nƣớc ấm để làm tăng nhiệt độ ủ nếu cần thiết. Trong

Xem chi tiết: Thiết lập quy trình điện di protein SDS-page và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với thuốc kháng sinh kích kháng